首页 | 再障常识 | 再障资讯 | 再障症状 | 再障检查 | 特色疗法 | 治疗方案 | 再障药物 | 患者护理 | 康复病例 | 慢性再障 | 急性再障 | 再障食疗
当前位置:中医再生障碍性贫血网 >再障常识 >浏览文章

再生障碍性贫血克隆性造血的研究进展

来源:互联网 编辑:yatao 浏览: 次 日期:2017年12月24日 关键字:
再生障碍性贫血(AA)是由造血干/祖细胞(HSPC)自身免疫性破坏所引起的骨髓造血功能衰竭症(BMF)。虽然免疫抑制治疗(IST)和造血干细胞移植(HSCT)明显改善了AA的预后,但部分患者进展为克隆性疾病,包括阵发性睡眠性血红蛋白

再生障碍性贫血(AA)是由造血干/祖细胞(HSPC)自身免疫性破坏所引起的骨髓造血功能衰竭症(BMF)。虽然免疫抑制治疗(IST)和造血干细胞移植(HSCT)明显改善了AA的预后,但部分患者进展为克隆性疾病,包括阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)。最新应用高通量测序技术进行的研究表明,部分AA出现克隆性造血,即使是儿童患者和最终不发展为MDS/AML患者,在疾病早期也可检测到这些克隆存在。克隆性造血并不一定意味着发展为癌症或其他疾病,其可在相当长的时间内保持稳定。髓系肿瘤中出现的体细胞突变也频繁地出现于AA患者。AA患者体细胞突变可能为其频繁出现克隆性造血提供了基础,进而发展为MDS及AML。这部分有克隆性造血证据的AA无论是克隆指标还是治疗转归均与无克隆性造血证据的AA截然不同,且符合近年学者们提出的"意义未明的克隆性血细胞减少症(CCUS)"。本文主要就近年来AA克隆性造血的最新进展及其晚期发展为克隆性疾病的机制作一综述。

一、克隆性造血的研究方法

1.非随机X染色体失活(NRXI):

基于NRXI的克隆性检测只适用于分析女性。健康女性体细胞中来自父方和母方的2条X染色体在胚胎发育早期随机失活并将其失活方式稳定传递给子代细胞,因此父方X染色体(Xp)和母方X染色体(Xm)失活的体细胞各占约50%。若某一组织起源于X染色体随机失活后的单一细胞,则其所有细胞将单一呈现Xp或Xm失活。进行X连锁克隆性检测的必备条件是X染色体上具备用以区分父本和母本来源的标记物,以作为检测靶点。X连锁克隆性检测的第一代标记物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)蛋白,利用3种G6PD同工酶(A+、A-和B)不同的电泳迁移率区分Xm和Xp。由于其杂合性受特定人种的制约,进而限制了该方法的应用。随后的克隆性检测过渡为DNA水平的检测,利用甲基化敏感的限制性内切酶的消化作用鉴别具有转录活性和失活的染色体,利用DNA片段长度多态性区别Xm和Xp。代表性标记物是人类雄激素受体(HUMARA)基因。但这类检测方法也存在一系列固有缺陷,如:基因的甲基化状态可能受到一些非遗传性因素和肿瘤形成过程的影响,因而影响实验结果的可靠性等;此外,DNA水平的分析不能研究无核细胞。第三代克隆检测方法,即基于转录的克隆性检测(TCA),可以在不同程度上克服第二代的缺点。该方法首先在DNA水平上通过X染色体上的多态性位点区别Xm和Xp,进而在mRNA水平上应用转录子鉴别出有转录活性的X染色体。目前可应用于该法检测的X-连锁多态性位点共5个,包括P55基因、G6PD基因、Bruton酪氨酸激酶(BTK)基因、4个半LIM结构域蛋白1(FHL-1)基因、艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)基因。

AA克隆性造血的早期研究多采用NRXI方法。Mortazavi等通过等位基因特异性限制位点的产生分析G6PD基因的杂合性,显示10/26(38%)的AA患者伴随NRXI。其他研究中所报道的频率较低(11%~20%)。产生差异的原因包括样本选取、检测方法和基因等。当然,不能除外这些有克隆性造血证据者实为CCUS或MDS,而非AA,特别是诸报道均为20年前的工作。

2.染色体异常:

细胞遗传学在血液病研究中有非常重要的作用,主要方法包括常规染色体分析和荧光原位杂交技术(FISH)。染色体分析主要检测克隆形成,并分析大片段染色体的缺失与突变,也适宜发现未知的异常,且常规染色体G显带为FISH分析提供可靠线索。但其操作流程复杂,而且只能分析分裂中期细胞,受中期分裂象数目和染色体形态的制约,有一定的失败率和漏检率。FISH利用特异性荧光标记探针与标本DNA杂交,能够提高异常核型的检出率,可应用于细胞分裂中期、间期染色体,弥补常规染色体技术中染色体中期分裂象质量不佳和数量不足的缺点,能够检测染色体数量异常和易位等结构异常,对已知微小异常更敏感可靠。但由于探针自身的局限,只能检测到特定染色体上的特异性改变,对于不确定的异常难以检出。因此,将常规染色体分析与FISH技术相结合能提高异常检出率,使结果更为准确。

细胞遗传学异常在AA中的发生率较低,为4%~11%。AA获得充足数量的分裂中期细胞有困难,极可能低估克隆性造血的真实频率(尤其是在诊断时)。AA发生染色体或者FISH异常多为数量异常,包括常在髓系肿瘤中出现的+8、-7和5q-,以及少见于MDS/AML的其他异常如+6和+15。在所有遗传学异常中以+8最为常见。-7往往预示AA的预后不良。13号染色体长臂缺失[del(13q)]对IST有较好的反应。

单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。单核苷酸多态性微阵列(SNP-A)技术是染色体芯片分析的常用方法之一,是将大量的SNP位点序列采用特殊方式固定在硅芯片上,获得高密度的SNP微阵列,然后与样本杂交,通过激光扫描、软件分析获得结果。SNP微阵列核型分析可以对传统的细胞遗传学检测进行补充,使得中期独立检测拷贝数异常(CNA)成为可能。同时,它较传统的核型分析而言具有更高的分辨率,能够检测基因拷贝数不变的基因杂合性缺失(LOH),也可以揭示较小的潜在性异常及中性复制、单亲二倍体(UPD),这些均不能通过传统染色体核型分析检测。

最常见的AA染色体变异是6号染色体短臂单亲双体(6pUPD)。SNP-A核型分析发现9%~13%AA存在染色体变异。Yoshizato等的研究表明,417例样本中可检出18例CNA,其中包括-7(7例)、del(13q)(2例)及其他(10例)。联合靶向测序及SNP-A核型分析可在47%的AA患者中识别出克隆性造血。Afable等的研究表明,SNP-A应用于AA可以补充常规染色体核型分析在克隆性染色体检测中的缺陷,也可以应用于诊断疑难病例,将AA与MDS加以区分。除了能够提高诊断的准确率,早期将SNP-A应用于检测克隆性病变可以更好地监测临床病程,更早地确定患者可能由AA演变为MDS/AML。其研究显示,9例AA患者中有4例(44%)在病程早期检测到-7的出现,最终均出现恶性进展。最近的研究表明,SNP-A可以在15%~20%的AA患者中识别出体细胞改变。

3.二代测序(NGS):

NGS又称高通量测序,能够一次对几十万到几百万个DNA分子进行序列测定,并且可以对一个物种的转录组和基因组进行细致全面的分析,所以又被称为深度测序。随着技术革新带来的成本降低,NGS以其高通量、高灵敏度的优势被越来越多地用于血液病的临床诊断中。因其灵敏度高,NGS可以检测到低于1%的突变,此外还能同时检测多个基因。体细胞突变是较NRXI或细胞遗传学而言更为可靠和敏感的用于检测克隆数量的标志,二代DNA测序以及对MDS/AML中突变基因的系列研究大大促进了AA体细胞突变与克隆性演变为MDS/AML之间关系的相关研究。因此,自Lane等首次报道以来,在过去的2年中有数个基于NGS的AA突变研究相继报道,所显示的突变频率介于5.3%至72.7%之间。

二、AA克隆性造血

1.AA克隆性造血的特点:

目前研究结果显示,AA突变最常累及的5个基因为PIGA、BCOR/BCORL1、DNMT3A和ASXL1。而MDS突变最为频繁的6个基因依次为:TET2、SF3B1、ASXL1、SRSF2、DNMT3A和RUNX1 (突变发生于>10%的病例)。Jaiswal等利用NGS对17 182例无血液病的被测者进行外周血DNA检测,通过识别160个基因上特征性的单核苷酸变异及小的插入或缺失检测血液肿瘤相关性体细胞突变,以明确年龄相关性克隆性造血(ARCH)的突变特点及预后。结果显示,突变主要发生于以下3个基因:DNMT3A(61.9%)、TET2(11.1%)和ASXL1(9.5%),其次为剪接因子(5.5%)、TP53(5.1%)和JAK2(4.8%)。AA、ARCH和MDS的克隆性造血均以年龄相关性胞嘧啶(C)转换为胸腺嘧啶(T)为特点。

DNMT3A和ASXL1基因突变在AA及AML/MDS中均显著,BCOR、BCORL1和PIGA基因突变在AA患者中更为显著,而JAK2、RUNX1、TET2和TP53基因突变在AA中则相对少见。AA患者基因突变在位点分布上与MDS/AML有高度重叠,且主要表现为移码、无义和剪接突变。但AA患者的变异等位频率(VAF)明显低于MDS(9.3%和30.4%)。新诊断样本和经6个月免疫抑制治疗的患者相比,基因突变的数目并无显著性差异,而突变频率在治疗后有显著提升。

AA基因突变有助于了解疾病演变,而且具有预后作用。BCOR、BCORL1和PIGA基因突变免疫抑制治疗疗效好,生存率高。异常基因的克隆倾向于保持较低的VAF或者随时间不断降低;而ASXL1、CSMD1、DNMT3A、RUNX1和TP53基因异常预示治疗效果差,生存期短,VAF不断增加,并向MDS或AML发展。

2.AA克隆性造血的机制:

通过DNA深度测序发现,体细胞突变的克隆性造血随年龄增长不断增加,转化为血液系统肿瘤和死亡的风险升高。这些突变或许代表血液系统肿瘤发展过程中特征性的早期事件。Genovese等的研究显示,42%的血液系统肿瘤在出现症状前6个月就检测到克隆形成。

两种基因突变参与AA克隆性选择:一种是经常出现于MDS/AML中的突变及基因拷贝数变异(如:-7、DNMT3A基因、ASXL1基因和其他突变);另一种是AA中高度特异或过度表达的突变(PIGA/BCOR/BCORL1基因突变和6pUPD)。这两种变异显示出不同的年代学行为、年龄分布、对IST反应的影响、MDS/AML进展率及总体生存率,提示克隆性选择的分离机制。

尽管DNMT3A基因和ASXL1基因突变在AA和MDS/AML中均频繁,其他MDS/AML相关突变的频率在两种疾病中却具有本质性差别。例如,TET2、JAK2基因代表ARCH中的普遍突变靶点,但它们在AA中却有很低的突变频率。携带不利突变的AA患者进展为MDS/AML的风险很高,而ARCH进展为MDS/AML的绝对风险仍然保持中等(0.5%/年~1%/年)。一种可能的解释是,与ARCH中有正常填充的骨髓环境相比,AA患者IST后骨髓由少量的残余干细胞重新构成,可以为具有增殖优势的克隆提供更多的增殖机会,因而使克隆占据主导("瓶颈效应")。由于免疫介导的骨髓破坏,一些克隆在骨髓恢复的过程中对激发的自身免疫损伤产生抵抗并显示出加快的细胞周期或减少的细胞凋亡从而获得克隆性优势。在一些病例中,优势克隆尤其是携带DNMT3A基因、ASXL1基因及其他不良突变的克隆增加其克隆数量,选择性地产生了更多的优势克隆。而在另一些病例中,通常是携带PIGA基因(也可能是BCOR/BCORL1基因)突变的克隆,最初的优势可能会逐渐退化或在若干年内保持稳定。另外一种解释是,自身免疫环境可以优先选择DNMT3A基因和ASXL1基因突变。

3.克隆性造血的选择:

Yoshizato等[2]提出,克隆选择的分离机制在疾病进展过程中起作用。通过对35例患者连续样本测序发现,克隆性造血通常起源于疾病初诊时就已存在的微量克隆,然而这些克隆后续的发展是高度可变的。部分突变克隆在数年内保持稳定,通常伴随持续性血细胞减少症。而另外部分病例突变克隆逐渐增多后占据主导地位,容易进展为MDS/AML,进展之前出现新的亚克隆。总之,克隆性造血通常起源于疾病早期的一小部分克隆,而它的演变则取决于额外突变的积累及随后的克隆选择。

AA的MDS/AML相关突变显示出明显的年龄依赖性,此外,在mCpG位点甲基化的胞嘧啶(C)自发转换为胸腺嘧啶(T)是AA中主要的核苷酸转换来源,相似的"C向T"转换同样发生于ARCH。提示这些突变可能有共同的起源,伴随年龄的增长随机获得。由于与MDS/AML有紧密联系,可推测这些突变在AA及普通人群中被克隆性选择,与MDS/AML的发展有相似的机制。普遍观点是,所有组织的干细胞,包括骨髓,倾向于在整个生命过程中积累体细胞突变。其中的大部分为随机突变,不具有促进克隆性扩增的功能性影响或潜能,平均每个造血干细胞每10年获得(1.3±0.2)个体细胞外显子突变。然而,一些突变被赋予自我更新优势、增殖优势或两者兼具,导致受影响的细胞克隆性扩增。尽管这些原始突变并不直接导致疾病,却可以联合随后的突变导致血液系统恶性疾病的发生。

AA特定突变或许与其功能改变相关,但突变选择的确切机制尚未明确。DNMT3A基因或ASXL1基因突变细胞优先进行自我更新而非分化,在骨髓衰竭的环境中表现得尤为活跃。骨髓衰竭和老化骨髓中突变克隆选择具有相似性。与AA患者相比,健康老年人中这些克隆出现的频率较低可能是由于深度测序对于检测小数量的异常细胞不够敏感。BCOR、BCORL1和PIGA基因突变以及6pUPD能够逃避由细胞毒性T淋巴细胞参与的免疫破坏,因而具备选择性优势。

4.克隆性造血免疫逃逸的机制:

最新研究表明,一些特定基因的突变使其在骨髓衰竭的过程中产生生存优势,逃避免疫介导的破坏(如HLAⅠ类基因的突变),增殖加快。Babushok等的研究数据表明,在较为年轻的AA患者群体中,体细胞突变主要集中于调节免疫及转录的基因,免疫逃避及增殖信号的产生成为克隆性造血的主要驱动力。研究结果表明:特异性HLA Ⅰ类等位基因通过两种不同机制的丢失[丧失功能的突变及6号染色体长臂拷贝数不变的杂合性缺失(CN-LOH)]驱动单克隆造血。另外两个候选驱动突变(CAMK2G基因和STAT5B基因)影响关键的增殖路径。

6pUPD和PIGA基因突变在AA中是高度特异的,免疫逃避可能是克隆性选择的机制之一。6pUPD代表AA中最频繁的基因损害,由2条同源染色体的重组产生,常涉及6号染色体短臂远端。所有6pUPD均涉及HLA Ⅰ类基因座,导致保留的HLA Ⅰ类等位基因的单亲表达。未知的致病抗原被呈递给细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的过程依赖于HLA Ⅰ类基因,6pUPD阳性的造血干细胞由于缺失HLA Ⅰ类基因,能够逃避CTL介导的免疫破坏。

AA患者中频繁出现多种PIGA基因突变克隆提示PIGA基因突变细胞具有强大的选择性优势,然而PIGA基因突变细胞逃避免疫破坏的潜在分子机制尚未明确。目前认为PNH发病的分子生物学机制是PIGA基因突变致GPI-锚连蛋白合成缺陷,有研究表示PNH克隆体内扩张得益于GPI-锚连蛋白的缺陷使其能躲避NGK2D途径的NK细胞和T淋巴细胞的免疫攻击。推测PIGA基因突变获得选择性优势的可能机制为,对免疫识别有重大意义的GPI-锚连蛋白失去表达。

5.克隆造血对AA诊断的价值:

随着测序技术的进展,很大比例的AA患者中均可检测出克隆性造血,然而克隆性造血并不一定意味着恶性转变。但体细胞突变的类型可以在一定程度上预测克隆的行为和患者的病程及预后,提示广泛应用NGS监视克隆性造血的重要性。AA高度特异性突变(如BCOR、BCORL1和PIGA突变)通常提示对免疫抑制疗法有好的效果并预后良好,而髓系肿瘤相关性基因突变(如ASXL1、DNMT3A、RUNX1和TP53突变)则往往预示MDS/AML转变、预后不良。因此,携带预后差突变的AA患者是诊断为MDS,还是继续诊断为AA成为一个争论的问题。当然,目前已有专家认为这类患者应诊断为CCUS或MDS,至少不应再诊断为AA了。

6.克隆性造血对AA治疗的价值:

Kulasekararaj等对150例经筛选的、不伴MDS形态学证据的AA患者进行SNP-A核型分析、相对端粒长度测量及基因测序。结果显示:19.3%(29/150)的AA患者具有血液系统恶性疾病(尤其是MDS/AML)相关性体细胞突变;伴随突变者与不伴突变者相比具有更长的病程(37个月和8个月)及更短的端粒长度(中位相对端粒长度分别为0.9与1.1)。病程>6个月且伴随体细胞突变的AA患者转变为MDS的风险远远高于不伴突变者(40%和4.5%)。结果显示,体细胞突变在预测MDS/AML演变上先于形态学异常。

MDS/AML相关性基因突变者病死率高,这部分患者可以采用异基因HSCT早期干预。而伴有PIGA、BCOR和BCORL1基因突变的患者,则可以推迟HSCT,首先进行IST。无上述分子克隆标志者免疫抑制治疗预后好。治疗过程中应定期应用包括NGS和FISH在内的检测手段,观察克隆变化,早期判断预后并干预治疗。将来进一步区分并限定这些患者将使AA诊断更"纯净"。

三、NGS时代的AA、MDS、未知潜能的克隆性造血(CHIP)、意义未明的特发性血细胞减少(ICUS)

NGS检测基因突变的进展,使得我们对许多疾病的发病机制有了进一步了解。MDS是克隆性造血干祖细胞疾病,以血小板减少、发育异常和高风险向AML转化为特征。多种基因突变参与MDS的发病。这些基因涉及表观遗传调控、染色质修饰、剪接体、信号和DNA修复通路等。MDS分子生物学的快速进展使得人们重新考虑MDS的定义,包括对最低限度诊断标准的重新评定。由于超过85%的MDS患者检测到≥1的常见体细胞突变,突变分析具有较高的阴性预测价值。尽管一种突变的出现并不意味着这个患者患有MDS,突变的缺失却能较好地预测该患者不患有MDS,使得临床的突变检测在不确定性血细胞减少的病例中发挥重要作用。

近期大规模测序研究已经揭示,造血细胞的MDS相关性基因获得克隆限制性体细胞突变的现象并不局限于MDS或相关髓系肿瘤个体。这些突变可以出现于伴随正常血细胞计数且没有任何明显疾病的人群,且它们的出现往往预示随后诊断为血液学恶性肿瘤的风险增加,同时也伴随更高的全因死亡率。但大多数在衰老过程中获得克隆性造血的个体永远不会进展为MDS/AML,因此提出了CHIP这一名词,用以描述由获得性体细胞突变驱动的克隆性扩增,且不伴有血细胞减少及造血功能异常等其他血液学恶性疾病的诊断证据。Jaiswal等对17 182个健康个体中的134例CHIP患者进行了长达95个月的随访,其中16例最终发展为血液系统肿瘤,其中5例(31%)发生于早期存在基因突变的基础上。缺乏血细胞减少证据的克隆性造血是未知潜能的,但传达了健康风险。

ICUS具有持续性血细胞减少,但缺乏明确致血细胞减少的病因。ICUS包含高度异质性人群,且ICUS可自发消退或最终被确诊为由非髓系肿瘤或非肿瘤条件所致。近期有两项在ICUS患者中进行的与体细胞突变相关的研究,这些患者均有持续性血细胞减少且缺乏MDS的诊断性证据。Kwok等报道,相当大比例携带MDS/AML相关突变的患者显示出与低危MDS相当的等位基因负荷。Cargo等对4 835例ICUS患者进行随访,有82例发展为MDS/AML,其中69例保存了ICUS阶段的外周血细胞。研究者对该69例患者ICUS阶段的外周血细胞进行深度测序及细胞遗传学检测,发现其中63例存在基因突变或染色体结构异常,突变基因谱与MDS相似。这些发现或许提示,携带MDS/AML相关突变的ICUS患者可以被认为患有MDS或处于即将发展为MDS的状态。

克隆性造血在AA中也普遍存在,克隆有可能恶性转变为MDS/AML,也可能继续支持正常造血。体细胞突变的类型可以在一定程度上预测克隆的行为及患者的临床病程,提示了目前广泛应用NGS监视克隆性造血的潜在价值。对不同突变克隆性选择潜在机制的理解有助于我们精确地诊断及预测恶性演变并为AA患者提供更好的管理。对于AA克隆性造血与治疗及患者结局之间关系的前瞻性研究有助于理解导致疾病演变的决定性因素,并可据此作出个体化治疗决策,提高临床疗效。而对于伴有多个MDS/AML相关基因突变、突变负荷高、恶性演变率高的"AA"应注意与低增生MDS鉴别,以避免混淆两类疾病的本质。总之,若限定AA为T细胞免疫异常损伤正常造血干细胞导致的骨髓衰竭,则有克隆性造血证据的"AA"即为混入AA"米"中的"砂子"。CCUS研究这些"砂子"并将其从"米"中剔除,既有利于正确认识AA,也有利于正确认识这部分克隆性血细胞减少症。


看了本文的患者还看了这些文章
康复患者
  • “肝炎后再生障碍性贫血”康复病
  • “重型再生障碍性贫血”康复病例
  • “再生障碍性贫血”康复病例-李瑞
  • “再生障碍性贫血”康复病例-范美
  • “再生障碍性贫血”康复病例-高梓
  • “重型再生障碍性贫血”康复病例
推荐阅读
热门