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再障的骨髓片检查

来源:互联网 编辑:yatao 浏览: 次 日期:2008年10月14日 关键字:再障 骨髓片检查
再障的骨髓片检查
一、制片
骨髓涂片制作方法与血片制作方法基本相同,但因有骨髓小粒和脂肪滴,有核细胞较多,因此较血液粘稠,推片略难于血片,推片时角度要小一些,速度要慢一些,避免骨髓片过厚。
二、染色
传统的骨髓涂片染色方法多用在Romanowsky染色基础上改良而成的Wright和Giemsa染色法。20世纪70年代,显微分光光度计和电子计算机的广泛应用,传统的形态学描述已开始被精确科学的数字所取代,常规的骨髓细胞染色方法也随之被重新研究和改良,形成了一些新改良的骨髓细胞染色方法。目前,临床常用的染色方法主要有:
(一)瑞氏(Wright)染色
Ⅰ液:瑞氏染料(伊红、美蓝)1.0g,AR级以上甲醇600ml,甘油15ml。
Ⅱ液:磷酸盐缓冲液(pH6.4~6.8)
使用时滴加Ⅰ液3~5滴0.5~1min后滴加等量Ⅱ液,染5~10分钟
(二)吉姆萨(Giemsa)染色
Ⅰ液:吉姆萨染料(伊红、天青)1.0g,甲醇66ml,甘油66ml。
Ⅱ液:磷酸盐缓冲液(pH6.4~6.8)
使用时用Ⅱ液将Ⅰ液稀释10-20倍,染色10~30min。
(三)Marshall提出的标准化的Romanowsky染色
Ⅰ液:美蓝9.0mg,天青B(thiocyanate)17.0mg,伊红13.0mg溶解于20ml1:1甘油甲醇。
Ⅱ液:0.00132M的sorensen磷酸盐缓冲液(pH6.4~6.8),使用时将Ⅰ液用100mlⅡ液稀释,染色10min。
(四)R-G(Romanowsky- Giemsa)染色
Ⅰ液:天青B130mg,伊红Y65mg分别溶解于50ml甲醇作为贮存液。
Ⅱ液:0.00132M的sorensen磷酸盐缓冲液(pH6.4-6.8)
使用时将Ⅰ液用Ⅱ液稀释,染色10min。
(五)wittekind1987年介绍的R-G染色
Ⅰ液:天青B750mg溶于75mlDMSO,伊红Y120mg溶于25mlDMSO混合作为贮存液。
Ⅱ液:1:25V/VpH6.5HEPES缓冲液。
使用时将Ⅰ液用Ⅱ液稀释,染色15~35min。
三、骨髓涂片、染色的质量保证
涂片和染色过程中应该注意的问题主要有:
1.载玻片要洁净,手指不要触及玻片表面。
2.穿刺后立即涂片并送检,避免血液凝固同时保证骨髓涂片在新鲜状态下染色。如遇特殊情况,陈旧玻片再染色时间不宜超过一周,以免蛋白质变性,染色偏碱和形态变异。
3.涂片一般不用抗凝剂以免影响细胞形态。
4.涂片时注意保留片尾和边缘,因体积较大的细胞多在此处。
5.应取骨髓小粒多的骨髓液制作涂片,至少要6~10张,自然干燥。
6.涂片制成后,应在空气中快速摇动或吹干,防止细胞皱缩或溶血。
7.骨髓涂片固定和染色的时间要较血片略长,最好放在低倍镜下观察,待染色满意时再冲洗。
8.若染色过浅,可于涂片干燥后重染,如染色太深可于干燥后滴加甲醛数滴,稍停后冲洗
四、骨髓涂片检查的内容及程序
(一)检查步骤  (骨髓涂片检查)
1.低倍镜检查
(1)观察涂片情况 观察涂片制作及染色是否满意,取材是否是真正的骨髓液等。若取材不好、涂片过厚、染色较差,则分类计数结果将不可靠,甚至造成误导,应另选涂片、染色较好的骨髓片进行检查,或重新取材。
(2)判断有核细胞增生程度 低倍镜下选择细胞分布均匀部位观察骨髓片有核细胞增生情况,根据骨髓片中有核细胞的密度或有核细胞与成熟红细胞的比例来估计有核细胞的增生程度。对增生减低的标本,应观察全部送检骨髓片,以免漏检有代表性的标本。
骨髓有核细胞增生程度通常分为五级,见表2-2-1。当增生程度介于两级之间时,则将结果划为上一级。例如在增生活跃与增生明显活跃之间时,可判断为增生明显活跃。在临床上这种增生程度的判断在很大程度上靠检查者的经验来估计。
骨髓增生程度的判断受骨髓取材好坏的影响很大,一般来说,只有当涂片中存在骨髓小粒时才宜于估计其增生程度,所以在骨髓穿刺时,最好将多余的穿刺液收集起来制作病理切片,通过组织切片观察骨髓小粒中的造血细胞多少更具有真实性和可靠性。
表,骨髓有核细胞增生程度五级估计标准

增生程度

成熟红细胞:

有核细胞

有核细胞均数

(高倍镜视野)

常见病例

增生极度活跃

 11

100

各种白血病

增生明显活跃

  101

50~100

各种白血病、增生性贫血

增生活跃

201

20~50

正常骨髓象、某些贫血

增生减低

501

5~10

造血功能低下

增生极度减低

 2001

<5

再生障碍性贫血


(3)观察全片巨核细胞的数量 巨核细胞数量变化较大,一张骨髓涂片上可有7~133个,平均36个。如将骨髓膜标准化为1.5cm×3.0cm(4.5cm2),则参考值为7~35个。在一般的骨髓检查报告单上可凭经验分为易找到、不易找到、增多三级记述。但在巨核细胞明显增多或疑为特发性血小板减少性紫癜时,则应作全片巨核细胞计数,并作分类。即在低倍镜下每见到一个巨核细胞,即用高倍镜或油镜确定其发育阶段和有无血小板形成,至少观察25个巨核细胞。
(4)观察骨髓片边缘和尾部 注意寻找有无体积较大的或成堆的特殊病理细胞,如转移癌细胞、多核细胞、尼曼-匹克细胞、戈谢细胞、Reed-Stemberg细胞、海蓝组织细胞等。
2.油镜检查   在低倍镜观察的基础上,选择较满意的片膜段,换用油镜观察。从涂片中段开始,迂回向尾端移动,如有核细胞很多,也可选择最好的部位观察。主要观察各细胞系的增生情况、各阶段细胞的组成和形态结构,并作细胞分类。
(1)骨髓细胞分类 先浏览该骨髓涂片上各类细胞的形态特点,观察其是否容易识别,然后再进行分类,要求计数200或500个有核细胞(不包括分裂型细胞和破碎细胞)。按各细胞的种类、发育阶段分别记录,并计算出百分比。
(2)各细胞系形态学观察 仔细观察各系、各阶段细胞的形态是否正常,例如:①色质情况:胞浆颜色以及是否有空泡、中毒颗粒、各种包涵体、吞噬物等,核浆比例以及有无核浆发育不平衡现象。②红细胞系:幼红细胞有无巨幼样改变,胞核有无不规则、固缩、碎裂、胞浆是否有嗜碱性点彩、Howell-Jolly小体等,有无核浆发育不平衡。并同时观察成熟红细胞的大小、形态、染色、结构等有无异常改变,有无人为造成的红细胞变形。③巨核细胞系:有无小巨核细胞、高分叶核或多个散在小核巨核细胞等,同时应注意血小板的数量、大小、聚集性、形态特征及颗粒变化等。④单核细胞、淋巴细胞、浆细胞等有无形态和数量改变,有无幼稚细胞。⑤非造血细胞,如组织细胞、组织嗜碱细胞、内皮细胞、吞噬细胞等是否有形态和数量的异常。⑥有无特殊的病理细胞,如转移瘤细胞、恶性组织细胞、骨髓瘤细胞等。⑦注意有无血液寄生虫,如疟原虫、黑热病小体、弓形体等。
另外,血涂片检查时,常分类记数100~200个白细胞,计算各类白细胞的百分率,描述红细胞形态,血小板数量和分布情况。如见到幼红细胞按分类100个白细胞中幼红细胞的数量来报告,并说明其阶段性。一般包括:①分类计数有核细胞,注意有无各类幼稚细胞,形态有无异常。②注意观察红细胞形态有无异常。③有无其他异常细胞出现。④观察血小板有无数量、形态、颗粒、聚集性等异常。⑤观察有无血液寄生虫,疑有血液寄生虫感染者应注意仔细查找。
(二)结果计算和报告单的书写
1.结果计算  计算出各系和各阶段细胞占有核细胞总数的百分数;再算出各阶段粒细胞百分数的总和与各阶段幼红细胞百分数之总和,将前者除以后者即得出粒:红比值(G:E)。这代表粒系和红系的相对数量关系,正常人约为2~4:1。如有核细胞增生亢进,G:E增大,则为粒系增多;如有核细胞增生低下,G:E增大,则为红系减少。
2.骨髓象报告单的填写  应用简明扼要的语言,突出重点,填写骨髓检查报告单。见表2-2-2和图2-2-5。
(1)“骨髓特征”一栏,其主要内容为:①对取材、涂片、染色的评价。②骨髓有核细胞的增生程度和粒红比值。③分别叙述各系细胞的情况。一般粒、红两个主要系列应说明其增生情况,细胞总数、成熟情况(系内各阶段细胞的比例是否正常,是否有成熟障碍)和细胞形态有无异常(必要时作扼要描述,并注意对成熟红细胞形态的描述)。其他系列如有明显异常改变,则应如粒、红系一样描述。④巨核细胞和血小板的数量、形态则由全片来评估。⑤是否见到特殊的病理细胞和寄生虫。
(2).报告血涂片检查结果 骨髓检查配合血涂片检查,对确定诊断是十分必要的,主要报告内容为:①有核细胞分类情况和细胞形态。②红细胞形态有无异常。③有无其他异常细胞出现。④血小板有无数量、形态、颗粒、聚集性等异常。⑤有无血液寄生虫。
(3)报告细胞化学染色结果。
(4)填写诊断意见 综合骨髓象、血象,结合临床资料,客观地向临床提出细胞学诊断意见或可供临床参考的意见,一般诊断意见有以下五种:①肯定性诊断:具有特异性细胞学变化的疾病,其临床表现与细胞学特征都典型时,或者细胞学变化既特异又非常典型,而无相应的临床表现者,可作肯定性细胞学诊断,如各类白血病。②符合性诊断:有特征性细胞学变化但特异性不强的疾病,临床与骨髓象符合,或骨髓象改变可以解释临床表现时,可提出支持某病的诊断的意见。如:“符合缺铁性贫血”。③疑似性诊断:骨髓发现小量病理细胞,但临床表现尚不典型,或骨髓象较为典型,但临床完全不相符时,则应考虑是否疾病的早期,可作动态观察,或提示建议作其它辅助性诊断试验,以明确诊断。④阴性(或排出性)诊断:常见于临床已初步诊断为某种血液病,但骨髓象不支持或骨髓象大致正常时,可供临床考虑是否排除此病。如骨髓象无巨幼细胞贫血的改变,又未用过维生素B12、叶酸治疗者,可排除此病。但应注意,某些血液病的早期,穿刺部位的骨髓尚未有明显的反应,特别是临床症状典型者,应作多次、多部位穿刺,经仔细检查,甚至长期追踪随访观察,才能否定。这种情况一般只能报告“大致正常骨髓象”。⑤描述骨髓象特征:若骨髓象有某些特征性但并非特异性的改变,对临床诊断提不出具体支持和反对意见,也不能用临床表现加以解释者,可直接扼要地描述骨髓象特征,继续观察和随访。
(5)打印报告单  将有诊断意义的典型骨髓图像、血涂片的细胞图像、细胞化学染色图像录入计算机,同时将骨髓报告单内容存入计算机,最后打印骨髓报告单。
(三)骨髓象检查的质量保证
1.经验  检验者的个人临床诊断水平是骨髓象检查质量保证的关键,检验者应有较丰富的临床工作经验,熟悉临床和病案。
2.涂片质量  骨髓的取材、涂片、染色对检验结果可靠性影响很大,操作者必须熟练掌握这些基本功。正确认识细胞形态是骨髓象检查的前提。各类细胞的形态特征变化幅度很大,检查者必须反复实践,积累经验;检查骨髓象一定要按具体步骤作全面的观察。
3.标记应用  利用单克隆抗体进行血细胞分类,是保证质量的必要手段。白细胞随着不同的分化期会产生各种各样的抗原,产生多种单克隆抗体。随着细胞分化的阶段不同,血细胞的细胞膜上会产生特异性的抗原,因此对细胞表面标志物(marker)的测定,在白血病的临床诊断上有十分重要的意义。如涂片上出现大量原始细胞,因各细胞系的原始细胞虽有特征,但相互之间极为相似,特别是有形态异常时更难以鉴别。可利用单克隆抗体进行血细胞分类。流式细胞技术是这个领域应用较多的技术,对于造血组织内血细胞的免疫表型检测、正常造血前体细胞分化程度的确定,以及造血细胞恶性特征的识别均具有重要意义,它可使形态学不易辨认的细胞得以正确区分。
(四)骨髓标本的保存和资料存档
血细胞形态学检查主要用于观察骨髓与血液中以及淋巴结涂片或印片细胞数量和质量的变化,借以了解造血功能。对疾病的诊断、疗效观察和判断预后等都具有重要价值。骨髓标本(含血涂片)须完整登记,并长期保存。故骨髓标本的保存和存档是一项重要的工作。必须做好以下工作:①骨髓涂片后,首先要立即登记编号,填写年龄、病历号、床号、骨髓采集部位及时间、次数、临床诊断及形态学诊断意见等。有条件的单位最好将其输入计算机以便长期保存和随时调用。②涂片后要立即固定染色,如有特殊情况,最迟不能超过24h,以防细胞皱缩、变性,从玻片上脱落。③填写细胞形态学报告单应一式两份,其中一份附申请单后,按年度以登记编号为序存档。④需投寄会诊时,应妥为包装防止损坏。⑤加镜油后的标本,务必用二甲苯将镜油洗脱干净,不得遗留油迹,否则容易褪色或弄脏。⑥编号归档时,玻片之间应有一定间隙,最好以薄纸袋装好玻片。
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